小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定ELISA試劑盒原理及應(yīng)用

一、小鼠單克隆抗體及用途

1、什么是單克隆抗體

在動(dòng)物體內(nèi)，抗體主要由漿細(xì)胞合成，漿細(xì)胞是一種終末分化的B淋巴細(xì)胞，因?yàn)闈{細(xì)胞不能在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)，所以不能用作體外抗體的來(lái)源，K?hler 和Milstein在1975年開(kāi)發(fā)了一種技術(shù)，該技術(shù)可以使分泌具有明確特異性的抗體的細(xì)胞克隆群生長(zhǎng)。從免疫動(dòng)物中分離出的抗體分泌細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(一種B細(xì)胞腫瘤)融合。這些雜交瘤細(xì)胞可以在體外維持生長(zhǎng)，并持續(xù)分泌具有特定特異性的抗體。由雜交瘤產(chǎn)生的抗體被稱(chēng)為單克隆抗體。

2、為什么選擇小鼠作為單抗來(lái)源

常用于制備單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括小鼠、大鼠、亞美尼亞倉(cāng)鼠和兔。其中常用的免疫接種對(duì)象是小鼠，來(lái)自BALB/c小鼠的骨髓瘤細(xì)胞是良好的融合細(xì)胞，絕大多數(shù)單克隆抗體來(lái)源于小鼠細(xì)胞，小鼠易于獲得遺傳背景一致的近交系品種、飼養(yǎng)成本低、易操作；其次，有很多試劑可用于檢測(cè)小鼠免疫球蛋白；另外，小鼠對(duì)外來(lái)蛋白質(zhì)能產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，致敏淋巴細(xì)胞與多種鼠源骨髓瘤細(xì)胞系能夠發(fā)生有效融合。

3、小鼠單克隆抗體的特點(diǎn)

小鼠單克隆抗體是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的均一性抗體，其核心特性在于能夠高特異性識(shí)別并結(jié)合特定抗原表位，且同一批次抗體分子結(jié)構(gòu)完全一致，呈現(xiàn)出納摩爾級(jí)高親和力。然而，小鼠單克隆抗體的高度特異性也導(dǎo)致其易受抗原表位變異影響而失效，且傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)需經(jīng)歷數(shù)月的細(xì)胞培養(yǎng)、克隆篩選及驗(yàn)證流程，成本高昂且技術(shù)門(mén)檻較高，阻礙了其在快速突變病原體或復(fù)雜表位靶點(diǎn)中的應(yīng)用廣度。

    多克隆抗體                                      單克隆抗體

4、小鼠單克隆抗體的用途

小鼠單克隆抗體是強(qiáng)大的免疫化學(xué)工具，已成為在生物醫(yī)學(xué)及工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛、較有價(jià)值的生物大分子。雜交瘤技術(shù)的發(fā)明及單克隆抗體的生產(chǎn)為科研工作帶來(lái)了很大的改變，為其提供了無(wú)限量的、獨(dú)特的單克隆抗體試劑，用于特異性抗原的識(shí)別、分離、清除、活化或檢測(cè)等。

二、小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)、亞類(lèi)、κ型和λ型

1. 小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)：依據(jù)重鏈C區(qū)的理化特性及抗原性的差異，小鼠單抗Ig類(lèi)可分為IgG，IgM，IgA，IgE和IgD 五大類(lèi)，重鏈分別為γ，μ，α，ε，δ，重鏈決定免疫球蛋白的種類(lèi)。

2. 小鼠單克隆抗體Ig亞類(lèi)：亞類(lèi)是根據(jù)重鏈恒定區(qū)的微細(xì)結(jié)構(gòu)、二硫鍵的位置與數(shù)目及抗原特性的不同進(jìn)行區(qū)分的。小鼠的IgG有IgGl，IgG2a，IgG2b，IgG3 四個(gè)亞類(lèi)，小鼠IgA、小鼠IgM、小鼠IgE和小鼠IgD未發(fā)現(xiàn)亞類(lèi)。

3. 小鼠單克隆抗體Ig的κ（Kappa）型和λ（Lambda）型：根據(jù)輕鏈恒定區(qū)的抗原性不同，小鼠單克隆抗體Ig的輕鏈分為κ（Kappa）和λ（Lambda）兩個(gè)型。任何種類(lèi)的免疫球蛋白均有兩型輕鏈分子。

三、為什么要對(duì)小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定

目前，雜交瘤單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用日益廣泛和深入。小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型的鑒定對(duì)McAb的進(jìn)一步研究具有十分重要的意義。

單克隆抗體的不同類(lèi)/亞類(lèi)/亞型在結(jié)構(gòu)上有所區(qū)別，其免疫源性與在體內(nèi)發(fā)揮的作用存在差異，在生物體內(nèi)具有不同的功能效應(yīng)，因此在篩選雜交瘤時(shí)需要確定高表達(dá)量的陽(yáng)性克隆是否是所需要的類(lèi)/亞類(lèi)/亞型分子，而且，明確抗體的類(lèi)/亞類(lèi)/亞型有助于選擇更加合適的抗體純化方法，能夠大大提高抗體獲得率，對(duì)抗體進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)分，并進(jìn)行抗體類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定，對(duì)于疾病作用機(jī)理的研究和抗體藥物的開(kāi)發(fā)，均有重要意義。

不同類(lèi)/亞類(lèi)/亞型抗體在抗體結(jié)構(gòu)（例如Fc區(qū)結(jié)構(gòu)、是否以多聚體形式存在等）及功能上（例如補(bǔ)體激活、半衰期等）也有所區(qū)別，進(jìn)行抗體亞型鑒定能夠更加清楚的了解手中抗體的結(jié)構(gòu)及功能，從而更好的應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn)。

四、小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定的方法

小鼠單克隆抗體 Ig 類(lèi)/亞類(lèi)/亞型的鑒定方法多樣，涵蓋血清學(xué)方法、免疫電泳、ELISA 、膠體金以及分子生物學(xué)方法等。在這些方法里，ELISA 鑒定法較為常用。該法靈敏度較高，即便是極微量的單克隆抗體也能夠精準(zhǔn)檢測(cè)出來(lái)。操作相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化流程，十分契合大量樣本的快速檢測(cè)需求。檢測(cè)結(jié)果可借助儀器精確讀取數(shù)據(jù)，進(jìn)而開(kāi)展定量分析，所獲數(shù)據(jù)客觀可靠，能夠為研究和應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)有力的支持 。

五、小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定ELISA試劑盒原理

小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定ELISA試劑盒利用雙抗體夾心法鑒定小鼠淋巴細(xì)胞雜交瘤培養(yǎng)上清中單克隆抗體或特異親和純化單克隆抗體的類(lèi)和亞類(lèi)（可區(qū)分出IgG1\IgG2a\IgG2b\IgG3\IgM\IgA\Kappa\Lambda）。采用小鼠抗體共有位點(diǎn)的二抗包被微孔板，與加入的培養(yǎng)上清中的小鼠抗體結(jié)合，再加入HRP標(biāo)記的抗小鼠各類(lèi)、亞類(lèi)、亞型的抗體來(lái)分別反應(yīng)， 隨后用TMB底物系統(tǒng)顯色并用稀硫酸終止，再通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度來(lái)判斷被測(cè)單克隆抗體的類(lèi)或亞類(lèi)。ELISA試劑盒具有極高的分辨率，是鑒定小鼠單克隆抗體類(lèi)、亞類(lèi)、亞型的可靠工具。

 雙抗體夾心法（Ab，抗體；Ag，抗原（小鼠抗體）；E，酶）

六、小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定ELISA試劑盒鑒定步驟

 1、先將試劑盒恢復(fù)室溫（大約30分），然后用純水把清洗液配成工作濃度（一份濃縮清洗液加19份純水）。

 2、取出酶標(biāo)板。每個(gè)標(biāo)本需要8孔，陽(yáng)性對(duì)照8孔，陰性對(duì)照8孔。多余的用自封袋保存，記得放入干燥劑。

 3、將標(biāo)本檢測(cè)孔每孔先加入標(biāo)本稀釋液各50μl。然后將50μl細(xì)胞培養(yǎng)上清（或特異親和純化的抗體）再加入酶標(biāo)微孔板，每個(gè)標(biāo)本加8孔；陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各8孔每孔100μl此處不加標(biāo)本稀釋液。貼上封板膜37℃溫育30分鐘。

 4、棄去板內(nèi)液體，手工洗板5遍后在不掉纖維的吸水材料上拍干（或機(jī)洗5遍）。再在每個(gè)標(biāo)本的8孔中分別加入8種酶標(biāo)二抗各100μl，通用陽(yáng)性、陰性對(duì)照的各孔也一樣。在加樣圖上或酶標(biāo)板上做好標(biāo)記。貼上封板膜37℃溫育30分鐘。

 5、吸棄板內(nèi)液體，手工洗板5遍后在不掉纖維的吸水材料上拍干（或機(jī)洗5遍）。每孔分別加入顯色劑A和顯色劑B各50μl，換一張新的封板膜貼板避光37℃顯色20分鐘。

 6、本試劑盒特異性好一般肉眼即可觀察出結(jié)果，看顯色藍(lán)的那個(gè)孔所對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)二抗就知道此標(biāo)本的Ig類(lèi)或亞類(lèi)。更可將反應(yīng)終止液（每孔50μl）終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀450nm測(cè)定波長(zhǎng)，630nm參考波長(zhǎng)雙波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果，參看高值孔所對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)二抗就知道此標(biāo)本的Ig類(lèi)或亞類(lèi)亞型(陽(yáng)性對(duì)照OD一般不小于0.8，陰性對(duì)照一般不高于0.15，陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：樣品OD大于陰性OD+0.15，陰性OD低于0.05按0.05算)。

七、試劑盒的選擇

1. 如果不需要對(duì)小鼠單克隆抗體Ig 的κ（Kappa）型和λ（Lambda）型進(jìn)行鑒定，可以選擇小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)鑒定試劑盒鑒定，鑒定步驟同上。如果同時(shí)需要對(duì)小鼠單克隆抗體Ig 的κ（Kappa）型和λ（Lambda）型進(jìn)行鑒定，則應(yīng)選擇小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定ELISA試劑盒進(jìn)行鑒定。

2. 小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)鑒定試劑盒、小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定試劑盒主要用于小鼠淋巴細(xì)胞雜交瘤培養(yǎng)上清中單克隆抗體或特異親和純化單克隆抗體的類(lèi)、亞類(lèi)、亞型的鑒別。

3. 在檢測(cè)腹水類(lèi)單抗時(shí)要稀釋到1/5萬(wàn)，雖然小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)鑒定試劑盒、小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定試劑盒也能分辨，但是由于此類(lèi)樣品成分十分復(fù)雜，有干擾結(jié)果的可能，這種情況下建議選擇小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定酶標(biāo)二抗即用套裝進(jìn)行鑒定。同時(shí)也可以使用抗原包被板替換試劑盒內(nèi)的包被板來(lái)解決此類(lèi)問(wèn)題，但這種情況下陽(yáng)性對(duì)照不顯色屬于正常。

4. 選擇小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定酶標(biāo)二抗即用套裝進(jìn)行鑒定時(shí)，很多試劑是需要自己準(zhǔn)備的，如果感覺(jué)麻煩，可選擇小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定。將會(huì)帶來(lái)非常滿(mǎn)意的試驗(yàn)結(jié)果。

八、注意事項(xiàng)

1. 手洗板子時(shí)一定要把孔加滿(mǎn)，停留10秒然后棄盡，甩干凈。特別是在酶標(biāo)二抗溫育后洗板時(shí)一定要把酶吸出而不是甩出，要吸凈。這個(gè)在手工洗板時(shí)對(duì)結(jié)果很重要。

2. 一次沒(méi)用完的板子要帶干燥劑放自封袋封好，隨盒存放。

3. 拿放板子時(shí)不要?jiǎng)×叶秳?dòng)，以免孔間交叉污染出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果。

4. 本試劑一般不會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)陽(yáng)性，但出現(xiàn)兩個(gè)陽(yáng)性的現(xiàn)象現(xiàn)實(shí)中是真實(shí)存在的，一般會(huì)一個(gè)OD很高，另一個(gè)很低但卻還能判為陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)分析表明這種情況下以OD高值孔為準(zhǔn)，出現(xiàn)這種情況有多重原因：A、培養(yǎng)的細(xì)胞中有“飼養(yǎng)細(xì)胞”殘留；B、由于單抗研制存在人工干預(yù)步驟因此抗體本身有可能會(huì)存在亞類(lèi)結(jié)構(gòu)上的輕微變異； C、樣品為非特異親和純化的抗體或樣品是腹水；D、上清出現(xiàn)少量污染；E、實(shí)驗(yàn)操作粗放；F、加錯(cuò)試劑。

5. 在使用小鼠單克隆抗體Ig類(lèi)/亞類(lèi)/亞型鑒定酶標(biāo)二抗即用套裝鑒定時(shí)，過(guò)于在強(qiáng)光或不良環(huán)境中頻繁開(kāi)啟管蓋有可能因此使效期縮短，顯色必須使用TMB系統(tǒng)。