小鼠單抗腹水的制備方法以及佐劑在腹水制備中的應用

1975 年，Kohler和Milstein發表了“分泌預定特異性抗體融合細胞的持續培養”的著名論文，具有劃時代意義的新技術：單克隆抗體(McAb)技術從此問世。各種用途的單克隆抗體可用不同的方法獲得，包括小鼠單抗腹水制備或通過各種雜交瘤細胞培養系統在體外生產。如下圖：

 小鼠腹水制備單抗是一種操作簡便、經濟的常用方法，主要用于生產科研或診斷用的單克隆抗體，是一般用途的單克隆抗體制備的方法。腹水中的單克隆抗體的濃度可達5~20mg/ml，是體外培養法的100~1000倍左右，是目前常使用的方法。

小鼠單抗腹水技術是通過將雜交瘤細胞接種至BALB/c小鼠腹腔內，利用其腹腔作為天然生物反應器，促使細胞增殖并分泌單克隆抗體的方法。產量高，經濟成本低，無需復雜設備，抗體在生理微環境中分泌，折疊正確且糖基化完整，活性更接近天然抗體。腹水制備單抗可以支持難培養細胞株。

1. 選擇免疫動物

在制備小鼠單克隆抗體腹水時，動物的選擇很重要，?BALB/c小鼠為常用品系，因其與大多數雜交瘤細胞具有遺傳相容性，BALB/c小鼠1923年育成，毛色為白色，BALB/c小鼠形成了許多亞系，如BALB/cAnN，BALB/cJ和BALB/cCd。乳腺癌發病率低，但對致癌因子敏感，血壓較高，多有心臟損害，兩性常有動脈硬化，對放射線極度敏感。常用于單克隆抗體和免疫學研究。BALB/c小鼠生產性能好，繁殖期長，一般無相互侵襲習性，比較容易群養。

優選8～12周齡成年鼠，體重需達18～20g以保證腹腔容量。老年鼠（如10月齡以上）會因代謝減緩而會影響腹水產量。雌性小鼠較常使用，因其腹腔空間較大且攻擊性較低。

2. 處理動物

通過目測和體重監測篩選健康個體，對小鼠進行病原體檢測，排除鼠痘病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒等病原體感染，實驗前需進行7天環境適應，觀察進食、排泄及活動狀態。在腹腔注射雜交瘤細胞之前，需先用石蠟油、降植烷或小鼠單抗腹水制備專用佐劑先處理小鼠，腹腔注射，0.5mL/只小鼠，處理腹腔15天左右，一般12～18天的預處理期，期間監測小鼠健康狀態。小鼠單抗腹水制備專用佐劑預處理小鼠腹腔，可引發腹腔內輕度炎癥反應，促進巨噬細胞和成纖維細胞聚集，形成富含營養的微環境，這種環境更有利于雜交瘤細胞定植并持續分泌抗體。佐劑在腹腔內形成油性基質，延緩雜交瘤細胞被免疫系統快速清除，從而延長細胞存活時間，增加抗體積累量，預處理后的小鼠腹腔能支持雜交瘤細胞高效增殖，產生的腹水量可達到未處理小鼠的1.5～2倍，同時抗體效價顯著提升。佐劑預處理后可降低腹腔內原有細胞成分的干擾，使后續離心純化時更容易分離出高純度抗體。實驗室有條件的情況下，建議用小鼠單抗腹水制備專用佐劑制備小鼠單抗腹水。

疫動物

小鼠單抗腹水制備專用佐劑預處理完小鼠腹腔后，注射雜交瘤細胞，建議每只注射80萬～100萬個。腹水會比普通佐劑晚出1.5天～2天，但通常情況下相同細胞株腹水的量是普通方法產出量的1.5倍左右，個別細胞株能到2倍以上且單抗腹水效價一般保持不變，相當于抗體產量增加50%-100%。

4. 收獲腹水

用一只手抓取并固定小鼠，繃緊腹部皮膚，另一只收將針頭刺入腹腔1～2cm，針頭刺入時應西安則左下腹或右下腹，避開上腹部的重要臟器和腹中線的大血管。抽取腹水。若操作中出現問題，可以參考以下解決辦法：

（1）若小鼠有大量的腹水但是無法流出，可以將針頭緩慢地旋轉，或換一個位置插入。

（2）若沒有腹水積蓄且小鼠的健康狀況尚好，可以重新注射細胞。

（3）若沒有腹水積蓄且小鼠死亡(尤其是在注射后2周內發生死亡)，下次注射時減少細胞的量。

（4）若形成了實體的腫瘤，將腫瘤細胞打散、重懸，并用以注射另一只小鼠單抗腹水制備專用佐劑預處理的小鼠。

（5）若只形成了少量的腹水，將其注射另一只預處理的小鼠（約0.5mL/只）。

（6）室溫下，1500g離心腹水10min。若液體在離心管內凝結，在離心前用細木棒在凝塊與離心管壁間刮一圈，若凝塊附在木棒上則將其丟棄，否則不做處理，離心后凝塊將成為沉淀的部分。

（7）取上清，棄沉淀。在所有腹水收集完之前將先離心得到的腹水保存于4℃(不超過1周)。

5. 檢測腹水效價

  可用ELISA法檢測腹水效價。

補充：小鼠抓握的方法

小鼠通常比較溫順，但被激怒后也會咬人。正確的操作會讓它們更加溫順。

（1）用手溫柔地抓住小鼠的尾巴，將其從籠中取出。將動物放置在籠蓋的柵欄上，向后輕微的牽拉尾巴。避免用噪聲和猛烈動作激怒動物。如下圖：

（2）用另一只手的拇指和食指從后頸部抓住耳后皮膚。將尾巴從優勢手移出來，用另一只手的小指壓住。

（3）觀察或注射動物。