HRP標記難，您選對試劑盒了嗎？

一、引言

為了在WB/IHC/IF等免疫學實驗中進行特異性蛋白的檢測，需要在抗體或蛋白質上偶聯上酶、熒光素、生物素、膠體金等追蹤物，并借助于熒光顯微鏡、酶標檢測儀或電子顯微鏡等精密儀器對試驗結果進行測定，從而可以在細胞、亞細胞、超微結構及分子水平上進行定性和定位研究，也可應用于各種液相和固相免疫分析中。

免疫酶標記技術是將抗原和抗體的免疫反應和酶的催化反應相結合而建立的一種新技術，酶與抗體或抗原結合后，既不改變抗體或抗原的免疫學反應的特異性，也不影響酶本身的酶學活性。酶標記中，常用的就是辣根過氧化物酶（HRP），HRP能通過催化有過氧化氫參與的一系列氧化還原反應并釋放信號，因此被廣泛應用于免疫印跡(WB)，酶聯免疫吸附 (ELISA)，以及免疫組織化學 (IHC) 等實驗中。

辣根過氧化物酶HRP上的糖羥基可以被高碘酸鈉活化生成醛基，這些醛基能通過Schiff堿與蛋白中的氨基偶聯，緊接著還原Schiff堿形成穩定的偶聯產物。雖然這種HRP標記方法已經被廣泛認可和應用，但是也存在一定的缺陷，標記過程較為繁瑣和耗時，而且標記后酶的活性容易丟失。洛陽佰盛生物技術有限公司提供了一種簡單快速的HRP標記試劑盒。能夠解決現有標記方法的這些缺陷。

圖1：HRP快速標記試劑盒（洛陽佰盛生物）

二、標記原理與應用

高碘酸鈉氧化法活化辣根過氧化物酶（HRP）的糖基，經過活化的HRP帶有醛基可以與待標記物的游離氨基結合，發生希夫堿反應（Schiff's base reaction）。本試劑盒適用于帶有游離氨基的物質的標記，比如：帶有游離氨基（伯胺）的抗體、蛋白或者小分子化合物。

試劑盒內包括：預活化HRP、標記啟動液、反應終止液干粉、標記物保存液、備用透析袋(MD6，截留量12KD）。

三、產品優勢

（1）活性強：可以標記100μg的抗體或蛋白。

（2）標記效果好，標記率高，標記后酶與抗體（蛋白）的活性均無重大損失。

（3）穩定性高：HRP以凍干粉狀態-20℃能保存數年，但在溶液中很不穩定且易失活（7天不失活），洛陽佰盛生物制備的試劑盒采用特有穩定技術，預活化的HRP在液體環境中4℃條件下可以保證1年內開啟有效。克服了HRP在液體中的不穩定性。

（4）操作過程快捷、簡單，活化后的HRP保存在液體中，吸取方便，無須柱純化步驟。

（5）利用率高：與凍干形式的活化HRP相比，能夠穩定保存在液體中的活化HRP減少了復溶過程及復溶后用不完廢棄造成的浪費，可以用多少吸取多少，幾乎不會產生損耗。

四、標記操作步驟

 （1）首先去除待標記抗體或蛋白中的疊氮鈉、以及含有氨基的緩沖成分物質，比如甘氨酸、Tris 等，還有EDTA等物質，可采用透析和超濾的辦法置換緩沖液，以去除干擾物質達到好的標記效果！透析或超濾緩沖液可選0.01M CB，PH:9.6緩沖液(0.01M CB，PH:9.6緩沖液配制：取NaHCO3，0.67g和Na2CO3，0.21g加水到1L溶解完全即可，不用調節PH），若實驗室沒有碳酸鹽試劑再采用0.01M PBS（PH:7.0～7.4均可）透析或超濾置換緩沖液，然后調整抗體或蛋白的濃度到2mg/mL。如果抗體和蛋白不含上述這些干擾物質可以直接用上述PBS或CB緩沖液調整濃度到2mg/mL備用。

（2）從4℃取出HRP標記試劑盒，使各組分充分混勻。

（3）取500μL抗體或蛋白（約1mg），加入50μL預活化HRP(1mg)液體中，用移液槍反復吹打幾次混勻，混勻后加入HRP標記啟動液99μL（加入啟動液量依據：

每10μL蛋白和HRP混合液加1.8μL啟動液）繼續混勻數次，避免產生氣泡。然后避光30℃～37℃溫箱偶聯反應2～3小時，若遇快要下班也可放4℃反應24小時左右（此法效果一樣或者更好不必擔心）。

（4）偶聯結束將反應終止液粉管中加入1mL去離子水混勻，取50μL加入3所述反應液中（加入終止液量依據：每1mg HRP加入終止液50μL），充分混勻，室溫放置1 小時或者4℃ 2小時。

（5）終止完成后，可直接加入等體積的標記物保存液，充分混勻，置于-20℃保存。如果想更上長期的保存建議先用0.067M PBS  PH:7.0（0.067M PBS， PH:7.0緩沖液配制：取NaH2PO4.2H2O，5.35g和Na2HPO4.12H2O， 11.7g以及NaCL，9g加水1L溶解完全，添加NaOH，0.35g再次混勻后即可，不用再調節PH）透析或超濾置換緩沖液后再加標記物保存液。這樣可以保存3年左右甚至更長。

圖2：標記過程

五、標記注意事項

（1）待標記物緩沖液成分過于復雜以及含有氨基小分子和NAN3的初始緩沖液必須透析或超濾置換掉，請采用0.01M PBS（PH:7.0～7.4均可）或0.01M CB，PH:9.6緩沖液均可。

（2）如果待標記物不是抗體是其它蛋白，那么請根據分子量參考蛋白和酶用量：若分子量在40KD以上建議1mg蛋白使用1mg HRP；如果分子量在30KD左右，建議1mg蛋白使用1.3mg HRP；如果分子量在20KD左右，建議1mg蛋白使用2mg HRP；如果分子量在10KD左右，建議1mg蛋白使用4mg HRP；此時啟動液和終止液請按步驟（3）和（4）描述標準適量加入；如果標記量為小于1mg的抗體或蛋白（可以0.1mg），HRP和其它試劑加入量按比例折算即可。

（3）小分子藥物不建議直接標記HRP，因為HRP的結構不能結合足夠的藥物會造

成效價偏低，這種情況建議先偶聯BSA增加小分子偶聯量再進行HRP標記，這樣效果會非常好。

（4）如果待標記物含有其它蛋白需要把無關蛋白同樣計算進去，盡管如此也請您慎重選擇這樣的樣品進行標記。

（5）本試劑盒保存4℃可以保證1年內開啟有效，活化HRP開啟后小心取用切勿污染堿性物質。

（6）終止液干粉一共5支，原則上每一支配好后僅限一次性使用，可以根據實驗總量合理配制使用。

六、公司簡介

洛陽佰盛生物技術有限公司位于十三朝古都、牡丹花城、中國歷史文化名城洛陽市。主要從事生物診斷技術與材料的研發、技術服務與技術轉讓；相關技術與材料的應用范圍涵蓋食品安全檢測、動物疾病診斷、人類疾病診斷、抗體制備、細胞培養及生命科學儀器等?？蛻糁饕ù髮W(食品科學院系、生物技術院系、醫學院系)、科研機構、食品安全診斷試劑公司、動物疾病診斷試劑公司、人類疾病診斷試劑公司。做好基礎研發，助力祖國科研是我們的主要目標。目前公司擁有或授權使用的商標有BIOABLAB\ABLAB。產品訂購電話：0379-60665856，18903798022。