BIOTIN快速標記試劑盒 產品說明書

 在您使用本產品前請認真閱讀說明書，這對您順利完成實驗很有幫助。

產品貨號：6213-50MG

產品名稱：BIOTIN快速標記試劑盒

原理與應用：本試劑盒提供有預活化的生物素BIOTIN---NHS，適用于帶有游離氨基的物質的標記，比如：帶有游離氨基（伯胺）的抗體、蛋白或者化合物。本試劑盒采用特有穩定技術，活化的BIOTON穩定保存在液體中，吸取使用方便，同時試劑盒組成、配方和操作力求兼顧和優化，讓您的標記工作變得簡單且更易把控和操作！和其它試劑盒不同，本試劑盒還額外增加了標記后標記效果所有核心試劑與實驗指導。

試劑盒組成：

操作步驟：

1. 從4℃取出BIOTIN快速標記試劑盒，恢復室溫（一般15分鐘左右）。

2. 首先要去除待標記抗體或蛋白中的含有氨基的緩沖成分物質，比如甘氨酸、Tris 等，可采用透析和超濾（透析袋和超濾管選擇參考附件3）的辦法置換緩沖液，以去除干擾物質達到好的標記效果！透析或超濾使用待標記物處理液進行（將待標記物處理液干粉充分溶解于純水即可，每袋配1L無需調節PH。配好可存放于4℃，3-6個月內用完），超濾的話先加上蛋白同體積的標記物處理液再進行超濾，第2次后每次加2倍原蛋白體積的待標記物處理液，通常超濾4次即可（遇到溶解度較低的蛋白超濾時可能因為過于濃縮而產生聚集堵塞影響超濾，這一類蛋白建議透析），透析的話每次50X-100X體積，一共4次，每次不低于2小時，也可過夜（12小時），過夜時請盡量100X以上體積，透析請在4℃冰箱進行，另外注意使用攪拌透析可以按2小時一次節省時間。

3. 然后將抗體或蛋白的濃度調整到2mg-5mg/mL之間，其它濃度也行但是會影響標記體積，需要注意其對耗材以及緩沖液使用規格與量的影響。

4. 按照每取100ul抗體加標記啟動液1.5ul后混勻，再按照每取1mg抗體或蛋白加活化BIOTIN 20ul,加完后迅速混勻開始進入標記過程，避光37℃ 2小時反應徹底。

5. 反應結束進行超濾或透析（透析袋和超濾管選擇參考附件3），超濾或透析請使用與要保存的保存液一致的緩沖液進行，推薦使用0.01M PBS（PH:7.0，無需調PH的經驗配方見附件2），一般超濾的話需要每次反應體積兩倍的緩沖液，通常超濾6次即可（超濾溶解度較低的蛋白時一定要注意，可能由于離心濃縮造成部分聚集此時建議透析更科學），透析的話每次50X-100X 體積，一共4次，每次不低于2小時，也可過夜（12小時），過夜時請盡量100X以上體積，透析請在4℃冰箱進行，另外注意使用攪拌透析可以按2小時一次節省時間。

6. 透析結束可以加上防腐劑或保護蛋白（防腐劑推薦0.1%NAN3或者0.1%PROCLIN-300,蛋白一般選擇BSA，如果后續實驗加蛋白有風險請慎重）。如是超濾，超濾結束請用0.01M PBS（PH:7.0，無需調PH的經驗配方見附件），按每毫克蛋白補足到0.5ml終體積即可，防腐劑添加量同透析。一切完畢后標記物建議-20℃保存，也可以短期4℃存放。

7. 標記后標記效果測試（請注意標記后不需要透析或超濾即可吸出部分標記物同時進行標記效果測試）：建議將標記物用0.01M CB,PH:9.6緩沖液進行包被微孔板，包被請采用倍比包被，12孔條首孔包被濃度2ug/ml（按投料的蛋白和體積計算濃度），第二孔1ug/ml以此類推每孔100ul，一共倍比包到12孔就好。37℃包被2-3小時或者4℃過夜都可以，包被結束用PBST洗一遍拍干（切記一定要洗一遍），然后加入HRP-SA工作液100ul/孔，37℃溫育30分鐘。溫育結束PBST洗板5次并拍干，加TMB顯色液100ul/孔，37℃溫育顯色20分鐘，顯色結束觀察或打印（顯色結束加50ul/孔 2M H2SO4終止，酶標儀單波長450nm讀數或者雙波長450nm/630nm與450nm/630nm讀數）。不顯色說明沒有標記上，顯色說明標記上但不同蛋白標記后效果有所不同,一般大多數蛋白在標記后按蛋白計包被濃度在16ng/ml時，也就是包被1.6ng/孔時（第8孔）,OD值在2.0左右（因各實驗室ELISA條件和用液不同此結果僅供參考）。

注意事項：

1. 小分子藥物不建議直接標記BIOTIN，BIOTIN標記后的作用及其有限，這種情況建議先偶聯BSA以增加每個偶聯物分子中小分子藥物和BIOTIN的偶聯量，這樣效果會非常好。

2. 如果待標記物含有其它蛋白需要把無關蛋白同樣計算進去，盡快如此也請您慎重選擇這樣的樣品進行標記。

3. 本試劑盒保存4℃可以保證1年內開啟有效，活化BIOTIN開啟后小心取用切勿污染堿性物質和含氨基物質，雖然此試劑盒中它被保護的很穩定但為了避免意外發生也盡可能在有效期內的3個月內用完。

4. 注意透析袋為贈品數量不能支持無限次數的標記，僅支持大體積為20ML的蛋白的一次性標記，更多次更微量的標記實驗請參考附件3使用實驗室常規的合適的透析袋或者超濾管進行。

5. 本試劑盒是按蛋白50mg足量標記BIOTIN 2倍的量準備和使用的活化生物素，是為了涵蓋客戶各種情況也能盡可能的確保標記的成功率。也就是說使用中可以根據實際情況減少到說明書操作要求的1/2的BIOTIN用量(比如1MG生物素標記可以標記20MG的蛋白也能取得較為理想的結果），減少后可以標記更多的蛋白。標記試劑盒還可以支持標記量100ug的蛋白標記。

附件：

1. 0.01M  CB ，PH:9.6緩沖液配制：取NaHCO3, 0.67g和Na2CO3, 0.21g加水到1L溶解完全即可，不用調節PH。

2. 0.01M PBS,  PH:7.0緩沖液配制：取NaH2PO4·2H2O，0.49g和Na2HPO4·12H2O, 2.39g以及NaCL，9g加水1L溶解完全即可，不用再調節PH。

3. 超濾管和透析袋的截留分子量選擇標準:首先要小于蛋白分子量，原則上可以小不能大。建議在蛋白分子量的1/8-1/2之間選擇，比如蛋白分質量160K,選擇20K-80K的截留量就好，根據經驗使用較多的透析袋外部尺寸型號為：MD10和MD34，當然也可以使用其它尺寸。

特別提示：如果您在實驗過程中遇到任何困難，請在及時聯系我們技術團隊獲取支持。